P53在卵巢粒层细胞瘤中的过度表达
作者：崔保霞 张文尧 江 森 杨兴升 张振国
单位：济南市(250012)山东医科大学 附属医院
关键词：
齐鲁肿瘤杂志980332
近10年来，卵巢癌的分子生物学进展迅速，发现了癌基因及抑癌基因的作用，其中以抑癌基因P53的研究最为广泛和深入。但大多数研究集中于卵巢上皮性癌，而对卵巢粒层细胞瘤(Granulosea cell Tumors,GCT)P53过度表达的研究国内尚未见报道。本研究采用免疫组织化学方法检测了P53在25例卵巢GCT中的表达情况，旨在探讨其与GCT的临床特点及患者预后的关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1标本来源 卵巢GCT组织取自山东医科大学附属医院病理科石蜡包埋的标本，共25份。所有标本均经重新切片，HE染色系统由两位病理科专家复核诊断为GCT，并进行组织学分级。查阅病历获得临床及随访资料。另取山东医科大学附属医院病理科石蜡包埋正常卵巢组织(亦经病理检查证实)标本10份作为对照。
1.2 试剂 P53单克隆抗体由美国Dako公司生产，购于福州迈新公司。采用链霉亲合素-生物素过氧化物酶复合物(SABC)染色系统，由博士德生物工程公司提供。
1.3 免疫组织化学染色 切片厚度为4μm，贴在玻璃片上，置60℃烤箱内，烘烤2h。常规脱腊、脱水，用磷酸缓冲液(PBS)冲冼后，将标本浸于3%过氧化氢PBS液中5min，灭活内源性过氧化物酶。PBS冼3次。加1：50正常羊血清封闭20min，倒去多余血清，加即用型P53单克隆抗体，置湿盒内4℃过夜。PBS冼3次。加1：100稀释SABC液，37℃下30min。PBS冼3次。DAB显色3～10min，自来水充分冼涤。苏木素复染30s，PBS浸泡至切片变蓝，自来水冼。酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。用已知P53阳性的乳腺癌组织作为阳性对照，用PBS代替第一抗体，作为阴性对照。
, 百拇医药
1.4 结果判定 GCT细胞无棕黄色颗粒为阴性(一)，有棕黄色颗粒为阳性。根据染色的强度和范围将阳性分为三级：弱阳性(+)，仅能在高倍显微镜下看到，分布范围<25%瘤细胞，强阳性(+++)，着色深，显而易见，分布范围>50%癌细胞，中度阳性(++)，介于(+)和(+++)之间。
1.5 统计学分析 因n=25<40，采用Fisher精确检验。用Kaplan-Meier法计算患者生存率，生存率的比较采用对数秩检验(Log-rank test)。
2 结果
2.1P53在卵巢层层粒细胞瘤的表达情况 25例卵巢GCT组织中，P53阳性者14例，占56%，其中(+)6例。(++)4例，(+++)4例。棕黄色颗粒主要分布在瘤细胞核上，少部分弥散在胞浆内。10份正常卵巢组织均未见有P53的表达。阳性对照全部为阳性，阴性对照全部为阴性。
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2.2 P53表达与卵巢粒层细胞瘤临床-病理指标间的关系P53的表达与卵巢GCT临床分期及有无残余瘤有关。P53表达率在Ⅲ～Ⅳ期显著高于Ⅰ～Ⅱ期组，在有残余瘤组明显高于无残余瘤组(均P<0.05)(见表1)。
表1 P53过度表达与卵巢GCT临床-病理指标间的关系 类别
n
年龄(yr)
临床分期
组织分级
瘤体大小(cm)
有无残余瘤
≥50 <50
, 百拇医药
Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ
1 2～3
≥15 <15
有 无
阳性
14
8 6
7 7
4 10
8 6
6 8
阴性
11
, 百拇医药
5 6
10 1
5 6
5 6
0 11
2.3 P53与患者预后的关系 全部病例随访均自术后第一天始，到1995年10月31日止，平均随访96个月。除1例失访外，死于本病者11例，死于高血压病者1例，余12例均存活。P53阳性者生存率较阴性者有下降趋势，但统计学分析差异未达到显著水平(P=0.0869)。3 讨论
卵巢GCT来源于卵巢性腺间质，多为一种低、中度恶性肿瘤，由于其发病率较低，仅占卵巢恶性肿瘤的6%～10%。给临床上病例收集带来困难。对GCT的遗传学研究较少。Kappes等检测15例卵巢性腺间质肿瘤(其中7例为GCT)的P53突变情况，均表现为野生型P53，无突变，认为这类肿瘤很少涉及P53突变。本研究采用免疫组化技术，发现25例卵巢GCT中有56%为P53为阳性，同多数文献报道卵巢上皮性癌的30%～80%阳性率相近，说明同卵巢上皮性癌一样，P53在卵巢GCT的发生发展中也可能起一定的作用。
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P53基因是抑癌基因，定位于人染色体17P13.1，编码分子量为53KDa的核磷酸蛋白。正常P53即野生型P53使细胞按正常程序性周期分裂、生长和死亡，防止肿瘤的发生。当P53基因突变后可导致P53基因失活。突变型P53在核内积聚，并表现显性癌基因转化作用。突变型P53的半衰期延长，可用免疫组化法测得。本研究所用的单克隆抗体不能区分突变型和野生型P53，但因野生型P53半衰期短，细胞内水平很低，故免疫组化法测得的P53即可认为是突变型的。许多研究表明，用免疫组化法检测P53的表达结果与其他遗传学技术检测P53点突变的结果有很高的一致性。另有报道，福尔马林固定较冰冻组织标本的P53阳性细胞数及染色强度稍低。但多数研究发现，二者的P53染色结果有很好的符合性。所以用福尔马林固定石蜡包埋的归档标本进行P53免疫组化研究，对发生率低的卵巢GCT来说，不仅方便且结果比较可靠。
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许多研究表明，P53过度表达与卵巢癌的生物学行为有关。Berchuk等利用免疫组化技术检测175例卵巢癌的P53表达情况，发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期P53表达率分别为10%、15%、40%、50%。其表达与组织学类型和分化程度无关。Levesque等用时间分解的免疫荧光技术(time-resolved imm-unofluorometric procedure)检测90例卵巢上皮性癌P53蛋白的表达，发现P53阳性表达率在Ⅲ～Ⅳ期组显著高于Ⅰ～Ⅱ期组,P53的表达还与组织分化程度、有无残余瘤、组织学类型有关。本研究发现卵巢GCTP53的表达与临床分期，有无残余瘤有关。分期愈晚，表达率越高，推测P53变化可能是癌变的晚发现象，在肿瘤的侵蚀性进展中可能起一定的作用。P53表达在有残余瘤组显著高于无残瘤组，因有、无残余瘤明显依赖临床分期，故对P53阳性率的影响可能归因于临床分期。本研究发现P53的过度表达与患者年龄、肿瘤组织分化程度及瘤体大小无关。本研究结果基本同Berchuk等及Levesque等的结果一致。P53在卵巢癌中的表达率及其与临床-病理指标间关系报道的差异很大，可能由所用抗体、染色方法、病例选择及样本大小不同所致。
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在卵巢癌中关于P53表达对患者的预后价值研究较多。Bosari等与Hartman等P53发现P53过度表达者预后不良。P53蛋白影响患者预后的机制可能是促使了肿瘤的侵蚀与转移能力，以及促使了多相耐药基因(MDR-1)的表达。也有学者认为P53的过度表达与患者预后无关。本研究发现P53阳性的GCT患者生存率有下降的趋势，但差异未达显著性，有待于加大样本量，延长随访时间，以得出P53表达对GCT患者预后有无影响的结论。
总之，卵巢GCT中确实存在P53的过度表达，且与临床分期有关，说明P53在GCT发生、发展中起一定的作用，但其确切作用及在临床诊治中的应用价值，尚需积累更多资料，深入研究。, http://www.100md.com
单位：济南市(250012)山东医科大学 附属医院
关键词：
齐鲁肿瘤杂志980332
近10年来，卵巢癌的分子生物学进展迅速，发现了癌基因及抑癌基因的作用，其中以抑癌基因P53的研究最为广泛和深入。但大多数研究集中于卵巢上皮性癌，而对卵巢粒层细胞瘤(Granulosea cell Tumors,GCT)P53过度表达的研究国内尚未见报道。本研究采用免疫组织化学方法检测了P53在25例卵巢GCT中的表达情况，旨在探讨其与GCT的临床特点及患者预后的关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1标本来源 卵巢GCT组织取自山东医科大学附属医院病理科石蜡包埋的标本，共25份。所有标本均经重新切片，HE染色系统由两位病理科专家复核诊断为GCT，并进行组织学分级。查阅病历获得临床及随访资料。另取山东医科大学附属医院病理科石蜡包埋正常卵巢组织(亦经病理检查证实)标本10份作为对照。
1.2 试剂 P53单克隆抗体由美国Dako公司生产，购于福州迈新公司。采用链霉亲合素-生物素过氧化物酶复合物(SABC)染色系统，由博士德生物工程公司提供。
1.3 免疫组织化学染色 切片厚度为4μm，贴在玻璃片上，置60℃烤箱内，烘烤2h。常规脱腊、脱水，用磷酸缓冲液(PBS)冲冼后，将标本浸于3%过氧化氢PBS液中5min，灭活内源性过氧化物酶。PBS冼3次。加1：50正常羊血清封闭20min，倒去多余血清，加即用型P53单克隆抗体，置湿盒内4℃过夜。PBS冼3次。加1：100稀释SABC液，37℃下30min。PBS冼3次。DAB显色3～10min，自来水充分冼涤。苏木素复染30s，PBS浸泡至切片变蓝，自来水冼。酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。用已知P53阳性的乳腺癌组织作为阳性对照，用PBS代替第一抗体，作为阴性对照。
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1.4 结果判定 GCT细胞无棕黄色颗粒为阴性(一)，有棕黄色颗粒为阳性。根据染色的强度和范围将阳性分为三级：弱阳性(+)，仅能在高倍显微镜下看到，分布范围<25%瘤细胞，强阳性(+++)，着色深，显而易见，分布范围>50%癌细胞，中度阳性(++)，介于(+)和(+++)之间。
1.5 统计学分析 因n=25<40，采用Fisher精确检验。用Kaplan-Meier法计算患者生存率，生存率的比较采用对数秩检验(Log-rank test)。
2 结果
2.1P53在卵巢层层粒细胞瘤的表达情况 25例卵巢GCT组织中，P53阳性者14例，占56%，其中(+)6例。(++)4例，(+++)4例。棕黄色颗粒主要分布在瘤细胞核上，少部分弥散在胞浆内。10份正常卵巢组织均未见有P53的表达。阳性对照全部为阳性，阴性对照全部为阴性。
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2.2 P53表达与卵巢粒层细胞瘤临床-病理指标间的关系P53的表达与卵巢GCT临床分期及有无残余瘤有关。P53表达率在Ⅲ～Ⅳ期显著高于Ⅰ～Ⅱ期组，在有残余瘤组明显高于无残余瘤组(均P<0.05)(见表1)。
表1 P53过度表达与卵巢GCT临床-病理指标间的关系 类别
n
年龄(yr)
临床分期
组织分级
瘤体大小(cm)
有无残余瘤
≥50 <50
, 百拇医药
Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ
1 2～3
≥15 <15
有 无
阳性
14
8 6
7 7
4 10
8 6
6 8
阴性
11
, 百拇医药
5 6
10 1
5 6
5 6
0 11
2.3 P53与患者预后的关系 全部病例随访均自术后第一天始，到1995年10月31日止，平均随访96个月。除1例失访外，死于本病者11例，死于高血压病者1例，余12例均存活。P53阳性者生存率较阴性者有下降趋势，但统计学分析差异未达到显著水平(P=0.0869)。3 讨论
卵巢GCT来源于卵巢性腺间质，多为一种低、中度恶性肿瘤，由于其发病率较低，仅占卵巢恶性肿瘤的6%～10%。给临床上病例收集带来困难。对GCT的遗传学研究较少。Kappes等检测15例卵巢性腺间质肿瘤(其中7例为GCT)的P53突变情况，均表现为野生型P53，无突变，认为这类肿瘤很少涉及P53突变。本研究采用免疫组化技术，发现25例卵巢GCT中有56%为P53为阳性，同多数文献报道卵巢上皮性癌的30%～80%阳性率相近，说明同卵巢上皮性癌一样，P53在卵巢GCT的发生发展中也可能起一定的作用。
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P53基因是抑癌基因，定位于人染色体17P13.1，编码分子量为53KDa的核磷酸蛋白。正常P53即野生型P53使细胞按正常程序性周期分裂、生长和死亡，防止肿瘤的发生。当P53基因突变后可导致P53基因失活。突变型P53在核内积聚，并表现显性癌基因转化作用。突变型P53的半衰期延长，可用免疫组化法测得。本研究所用的单克隆抗体不能区分突变型和野生型P53，但因野生型P53半衰期短，细胞内水平很低，故免疫组化法测得的P53即可认为是突变型的。许多研究表明，用免疫组化法检测P53的表达结果与其他遗传学技术检测P53点突变的结果有很高的一致性。另有报道，福尔马林固定较冰冻组织标本的P53阳性细胞数及染色强度稍低。但多数研究发现，二者的P53染色结果有很好的符合性。所以用福尔马林固定石蜡包埋的归档标本进行P53免疫组化研究，对发生率低的卵巢GCT来说，不仅方便且结果比较可靠。
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许多研究表明，P53过度表达与卵巢癌的生物学行为有关。Berchuk等利用免疫组化技术检测175例卵巢癌的P53表达情况，发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期P53表达率分别为10%、15%、40%、50%。其表达与组织学类型和分化程度无关。Levesque等用时间分解的免疫荧光技术(time-resolved imm-unofluorometric procedure)检测90例卵巢上皮性癌P53蛋白的表达，发现P53阳性表达率在Ⅲ～Ⅳ期组显著高于Ⅰ～Ⅱ期组,P53的表达还与组织分化程度、有无残余瘤、组织学类型有关。本研究发现卵巢GCTP53的表达与临床分期，有无残余瘤有关。分期愈晚，表达率越高，推测P53变化可能是癌变的晚发现象，在肿瘤的侵蚀性进展中可能起一定的作用。P53表达在有残余瘤组显著高于无残瘤组，因有、无残余瘤明显依赖临床分期，故对P53阳性率的影响可能归因于临床分期。本研究发现P53的过度表达与患者年龄、肿瘤组织分化程度及瘤体大小无关。本研究结果基本同Berchuk等及Levesque等的结果一致。P53在卵巢癌中的表达率及其与临床-病理指标间关系报道的差异很大，可能由所用抗体、染色方法、病例选择及样本大小不同所致。
, http://www.100md.com
在卵巢癌中关于P53表达对患者的预后价值研究较多。Bosari等与Hartman等P53发现P53过度表达者预后不良。P53蛋白影响患者预后的机制可能是促使了肿瘤的侵蚀与转移能力，以及促使了多相耐药基因(MDR-1)的表达。也有学者认为P53的过度表达与患者预后无关。本研究发现P53阳性的GCT患者生存率有下降的趋势，但差异未达显著性，有待于加大样本量，延长随访时间，以得出P53表达对GCT患者预后有无影响的结论。
总之，卵巢GCT中确实存在P53的过度表达，且与临床分期有关，说明P53在GCT发生、发展中起一定的作用，但其确切作用及在临床诊治中的应用价值，尚需积累更多资料，深入研究。, http://www.100md.com